ДЕЙСТВИЕ ПРОЛИН-БОГАТЫХ ПЕПТИДОВ ВРОЖДЁННОГО ИММУНИТЕТА НА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВЫЕ ШТАММЫ БАКТЕРИЙ

Резюме. Резистентность патогенных микроорганизмов к применяемым в медицине антибиотикам в последние годы стремительно растет, повышается смертность от внутрибольничных инфекций. Поэтому поиск новых лекарственных средств для борьбы с антибиотикоустойчивыми бактериями является одной из первоочередных задач биомедицины. Есть все основания считать, что природные соединения, содержащиеся в защитных клетках человека и животных, могут послужить прототипами принципиально новых антибиотических препаратов. К таким соединениям относятся антимикробные пептиды врожденного иммунитета, в частности группа пролин-богатых пептидов. Целью данной работы явилось исследование антимикробной активности пролин-богатых пептидов семейства бактенецинов в отношении ряда клинических изолятов антибиотикоустойчивых грамотрицательных бактерий. Объектами исследования послужили бактенецины, обнаруженные ранее в лейкоцитах домашней козы Capra hircus: ChBac3.4, ChBac5, miniChBac7.5Nα, miniChBac7.5Nβ. Установлено, что химически синтезированные нами аналоги этих пептидов проявляют выраженную антимикробную активность в отношении Escherichia coli и Acinetobacter baumannii (минимальные ингибирующие концентрации (МИК), определенные методом серийных разведений в жидкой питательной среде, находились в пределах 1-4 мкМ) и в несколько меньшей степени в отношении Pseudomonas aeruginosa и Klebsiella pneumoniae (МИК – 2-16 мкМ) in vitro. Показано, что антибактериальная активность пептидов может повышаться при их совместном использовании с антибиотиками, применяемыми в медицине. Выявлен синергический эффект при действии бактенецина mini-ChBac7.5Nα в комбинации с амикацином на E. coli (минимальный индекс фракционной ингибирующей концентрации (иФИК) – 0,375), A. baumannii (иФИК 0,5) и K. pneumoniae (иФИК – 0,325), а также с офлоксацином – на K. pneumoniae (иФИК – 0,5). Важной характеристикой исследуемых пептидов является отсутствие у этих соединений гемолитической активности в отношении эритроцитов человека при применении их в концентрациях, в несколько раз превышающих антимикробные. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего исследования рассматриваемых пролин-богатых пептидов и их структурных модификаций для разработки на основе этих соединений новых комбинированных лекарственных средств для борьбы с антибиотикоустойчивыми микроорганизмами: различных препаратов местного применения, компонентов изделий медицинского назначения, в частности венозных катетеров, стентов, а также раневых покрытий.

Ключевые слова: врожденный иммунитет, антибиотикорезистентные бактерии, пролин-богатые пептиды, бактенецины 

Работа поддержана грантом РФФИ № 17-04- 02177. 

Проблема устойчивости микроорганизмов к применяемым в медицине антибиотическим препаратам все более остро встает в последние годы. Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) опубликован список «приоритетных патогенов» – 12 видов бактерий, устойчивых к действию антибиотиков и представляющих наибольшую угрозу для жизни и здоровья человека. Особое внимание в сообщении ВОЗ уделяется мультирезистентным грамотрицательным бактериям. К числу наиболее опасных представителей таких бактерий, отнесенных к 1 категории приоритетности, принадлежат Acinetobacter, Pseudomonas и различные виды семейства Enterobacteriaceae (включая Klebsiella, E. coli, Serratia и Proteus), устойчивые к карбопенемам и другим антибиотикам и вызывающие тяжелые, часто неизлечимые, госпитальные инфекции. Данный список приоритетных возбудителей был составлен ВОЗ, чтобы предоставить ориентиры первоочередных разработок для научно-исследовательских организаций. Наша работа посвящена исследованиям в этом направлении, что и определяет ее актуальность. Среди возможных кандидатов на роль новых антибиотических препаратов – природные антимикробные пептиды (АМП) врожденного иммунитета. Эти пептиды содержатся в клетках организма, выполняющих защитную функцию, – в первую очередь, в фагоцитах, клетках барьерных эпителиев, а также, в меньших количествах, и во многих других типах клеток. Кроме прямого антимикробного действия многие АМП проявляют иммуномодулирующие эффекты, что тоже способствует ограничению микробной инвазии [1, 9]. Некоторые пептиды обладают и ранозаживляющим действием [2, 7]. АМП имеют разные структуры – в эту группу объединяются как пептиды, содержащие дисульфидные мостики и имеющие в составе молекулы β-слои, в том числе АМП с конформацией β-шпильки, так и линейные молекулы. К одной из обширных групп линейных пептидов относятся пролин-богатые АМП (ПБ-АМП). В составе молекулы ПБ-АМП присутствует большое количество остатков пролина (до 50%) и аргинина, что и определяет их физико-химические и биологические свойства. Подобные пептиды обнаружены у беспозвоночных, причем наиболее часто встречаются у насекомых [12], а также позвоночных – в основном выявлены в лейкоцитах животных отряда парнокопытных [13]. Известно, что многие ПБ-АМП проявляют высокую антимикробную активность в отношении грамотрицательных бактерий, в том числе и антибиотикоустойчивых, что позволяет рассматривать их в качестве прототипов новых лекарственных средств, эффективных в борьбе с патогенными микроорганизмами, резистентными к применяемым в клинике антибиотикам. В Санкт-Петербургском университете уже разработано несколько иммуномодулирующих и антимикробных препаратов на основе ПБ-АМП насекомых [3]. В Европе также создается антибактериальный препарат на базе одного из пептидов насекомых – А3-АРО [11]. Необходимость дальнейшего интенсивного изучения ПБ-АМП и разработки подобных препаратов в нашей стране не вызывает сомнений.

Целью данной работы явилось исследование антимикробной активности пролин-богатых пептидов семейства бактенецинов (ChBac3.4, ChBac5, miniChBac7.5Nα, miniChBac7.5Nβ) в отношении антибиотикоустойчивых грамотрицательных бактерий (Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli). Перечисленные пептиды, относящиеся к ПБ-АМП млекопитающих, были выделены нами ранее из лейкоцитов домашней козы Capra hircus и охарактеризованы [4, 14, 15]. Для сравнения использовали антимикробный пептид, имеющий другую структуру (конформацию бета-шпильки) – протегрин 1 (ПГ1) [8]. Учитывая, что, по данным ВОЗ, указанные выше грамотрицательные бактерии относятся к списку наиболее опасных патогенов, исследования, посвященные поиску новых антимикробных лекарственных средств, эффективных в борьбе с этими микроорганизмами, являются актуальными и перспективными.

Материалы и методы

Антимикробные пептиды получены методом химического твердофазного синтеза с использованием Fmoc/tBu-стратегии на 2-хлортритилхлоридной смоле. Наращивание пептидной последовательности проводилось в автоматическом синтезаторе Symphony X (Protein Technologies Inc., США). Для временной защиты α-аминогрупп аминокислот применялась Fmoc-защита. Активация проводилась in situ под действием HCTU/N-этилморфолин в среде диметилформамида. Аминокислотная последовательность отщеплялась с полимера с одновременным удалением всех защитных групп под действием трифторуксуной кислоты с добавками H2O/Tis (триизопропилсилан). Пептиды очищали с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) на установке Gold System (Beckman, США) и высушивали. Чистота полученных пептидов была не менее 95%, что подтверждалось с помощью аналитического электрофореза, ОФ-ВЭЖХ и масс-спектрометрического анализа (MALDIToF MS) на приборе Ultraflextreme фирмы Bruker (Германия).

Бактерии

Использовали клинические изоляты грамотрицательных микроорганизмов: Escherichia coli 521/17 (устойчивость к ампициллину, амоксициллину/клавулоновой кислоте, цефотаксиму, цефтазидиму, цефелиму, азтреонаму, нетилмицину, ципрофлоксацину, триметоприму/ сульфаметоксазолу), Pseudomonas aeruginosa 522/17 (устойчивость к меропенему, цефтазидиму, цефелиму, амикацину, гентамицину, нетилмицину, ципрофлоксацину, колистину), Klebsiella pneuimoniae 344/17 (устойчивость к ампициллину), Acinetobacter baumannii 7226/16 (устойчивость к имипенему, гентамицину, тобрамицину, ципрофлоксацину, триметоприму/сульфаметоксазолу). Клинический изолят E. coli был получен из мочи пациента, остальные – из инфицированных ран.

Оценку антимикробной активности проводили методом серийных разведений в жидкой питательной среде. Использовали стандартную методику, но с небольшими модификациями, разработанными с учетом специфики АМП [5]. В качестве жидкой питательной среды использовали бульон Мюллера–Хинтона (Oxoid, Германия). Двукратные серийные разведения исследуемых препаратов проводили в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4 с 150 мМ NaCl (НФБ) и вносили в лунки стерильной микрокамеры Терасаки, куда затем добавляли суспензии микроорганизмов, находящихся в фазе логарифмического роста (1 × 104 КОЕ на лунку). Пробы инкубировали при 37 °С в течение 24 или 48 часов. За минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) принимали наименьшую концентрацию вещества, при использовании которой отсутствовал видимый рост микроорганизмов в соответствующих лунках микрокамеры. Для каждого разведения образца или контрольных проб результаты исследований представлены как медианы, полученные по данным трех независимых экспериментов. 

Характер совместного действия пептидов и антибиотиков (наличие аддитивных, синергических, антагонистических эффектов) исследовали с использованием метода «шахматной доски» (“checkerboard array”) [5]. При изучении совместного действия веществ А и B двукратные разведения одного из исследуемых соединений (вещество А) производили в камере Терасаки по горизонтали, а другого (вещество В) – по вертикали. После инкубации проб с микроорганизмами в течение 24 или 48 часов определяли МИК каждого из исследуемых веществ и МИК для их комбинаций. Далее рассчитывали индексы фракционной ингибирующей концентрации (иФИК; FICI – fractional inhibitory concentration index) по формуле: 

ФИК индекс = ФИК A + ФИК B = [A]/ [МИК A] + [B]/[МИК B], 

где [А] и [В] – МИК веществ А и В, соответственно, в их смеси (комбинации), при которых наблюдается ингибирование роста бактерии; [МИК А] и [МИК В] – МИК индивидуальных фракций веществ А и В соответственно. При иФИК ≤ 0.5 совместное действие соединений рассматривали как синергическое (препараты усиливают антимикробный эффект друг друга); 0.5 < иФИК ≤ 1 – как аддитивное (антимикробный эффект препаратов аддитивно складывается); 1 < иФИК ≤ 2 – как индифферентное или независимое (эффект одного вещества никак не зависит от присутствия другого); иФИК > 2 – как антагонистическое (эффект веществ в комбинации снижается). 

Для определения гемолитической активности пептидов использовали эритроциты человека. Кровь здорового донора собирали в пластиковые гепаринизированные пробирки, центрифугировали в течение 10 мин при 250 g при 4 °С. Супернатант удаляли, к осадку добавляли 10 мл охлажденного забуференного физиологического раствора (ЗФР), рН 7,4 с 4 мМ ЭДТА, центрифугировали в течение 10 мин в тех же условиях. Надосадочную жидкость удаляли, процедуру отмывания эритроцитов ЗФР повторяли три раза. Из полученного осадка эритроцитов отбирали 280 мкл, доводили объем суспензии до 10 мл охлажденным ЗФР. Анализируемые пептиды по 3 мкл на пробу в ЗФР вносили в пластиковые пробирки объемом 0,5 мл, добавляли по 27 мкл суспензии эритроцитов и инкубировали 30 мин при периодическом перемешивании. Для получения положительного контроля (100% лизис эритроцитов) к 27 мкл раствора эритроцитов добавляли 3 мкл детергента (10% раствор Triton X-100 в ЗФР). Для получения негативного контроля (0% лизис эритроцитов) к 27 мкл раствора эритроцитов добавляли 3 мкл ЗФР. После инкубации реакцию останавливали добавлением 75 мкл охлажденного ЗФБ, пробы центрифугировали при 5000 g при 4 °С в течение 4 мин. Супернатант отбирали и проводили измерение оптической плотности проб при длине волны 540 нм на фотометре Multiscan (Labsystems, Финляндия). Процент гемолиза эритроцитов рассчитывали по формуле: 

Гемолиз (%) = [OD₅₄₀(образца) – OD₅₄₀(0% лизис)]/[OD₅₄₀(100% лизис) – OD₅₄₀ (0% лизис)] × 100 %. 

Эксперименты повторяли три раза, для каждой из опытных или контрольных проб имелось по три повторности. Результаты представлены как средние величины и среднеквадратичные отклонения. 

Результаты и обсуждение 

Исследована активность антимикробных пептидов (АМП) в отношении четырех видов грамотрицательных бактерий, относящихся к группам патогенов, приведенных в списке ВОЗ как одни из самых опасных для человечества видов, являющихся причиной внутрибольничных инфекций. Использованные в работе микроорганизмы проявляли резистентность к ряду применяемых в медицине антибиотиков. Данные, полученные методом серийных разведений в жидкой питательной среде, представлены в таблице 1. 

ТАБЛИЦА 1. МИНИМАЛЬНЫЕ ИНГИБИРУЮЩИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ (МИК) БАКТЕНЕЦИНОВ И ПРОТЕГРИНА 1, мкМ*

Установлено, что антимикробные пептиды, относящиеся к классу пролин-богатых пептидов млекопитающих, а именно бактенецины лейкоцитов домашней козы, проявляют выраженную активность в отношении E. coli и A. baumannii и, хотя и в меньшей степени, P. aeruginosa и K. pneumoniae. Пептид протегрин 1, имеющий структуру бета-шпильки и, как показано ранее, обладающий высокой мембранолитической активностью, проявлял значительное антибактериальное действие в отношении всех исследованных микроорганизмов. Однако его гемолитическая активность в отношении эритроцитов человека была существенно выше по сравнению с эффектами бактенецинов, которые не вызывали лизиса эритроцитов в концентрациях, значительно превышающих антимикробные (табл. 1), что свидетельствует о более высокой цитотоксичности этих соединений по отношению к прокариотическим клеткам по сравнению с клетками макроорганизма. В работах итальянских исследователей показано, что синтетические пептиды, являющиеся фрагментами бактенецина быка Вас7 (сходные по первичной структуре с мини-бактенецинами козы), тоже проявляют антимикробную активность в отношении антибиотикоустойчивых клинических изолятов [6]. Эффективность бактенецинов, вероятно, определяется тем, что эти пептиды имеют несколько молекулярных мишеней в бактериальных клетках [10, 13]. Однако значения активности АМП могут показаться несколько более низкими по сравнению с активностью применяемых в медицине антибиотиков. Чтобы выяснить возможность повышения активности пептидов, нами исследовано их совместное действие с двумя антимикробными препаратами – амикацином и офлоксацином – для установления наличия или отсутствия синергидного эффекта. Данные анализа антибактериального действия одного из мини-бактенецинов – miniChBac7.5Nα с перечисленными антибиотиками в отношении исследуемых клинических изолятов представлены в таблице 2.

ТАБЛИЦА 2. СОЧЕТАННОЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ МИНИ-БАКТЕНЕЦИНА miniChBac7.5Nα С АНТИБИОТИКАМИ, ОЦЕНИВАЕМОЕ ПО ВЕЛИЧИНЕ ИНДЕКСА ФРАКЦИОННЫХ ИНГИБИРУЮЩИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ (ФИК), РАССЧИТАННОГО ДЛЯ ПРИВЕДЕННЫХ КОМБИНАЦИЙ

Показано, что для трех из четырех исследованных видов бактерий наблюдается синергическое антимикробное действие мини-бактенецина с амикацином (ФИК ≤ 0,5), причем оно установлено и в случае A. baumannii, проявляющего устойчивость к ряду аминогликозидов. В комбинации с офлоксацином выявлен синергический эффект в отношении K. pneumoniae. 

Заключение 

Установлено, что пролин-богатые пептиды – синтетические аналоги бактенецинов лейкоцитов домашней козы – проявляют антимикробное действие в отношении исследованных антибиотикоустойчивых грамотрицательных бактерий, причем в ряде случаев наблюдали синергические антибактериальные эффекты при использовании пептидов с амикацином и офлоксацином. Изучаемые пептиды – бактенецины – не обладают гемолитическим действием в отношении эритроцитов человека. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего исследования рассматриваемых пролин-богатых пептидов и их структурных модификаций для разработки на их основе новых лекарственных препаратов для борьбы с микроорганизмами, представляющими серьезную опасность для пациентов. Использование пептидных препаратов в комбинации с применяемыми в клинике антибиотиками позволит повысить эффективность антимикробной терапии при местном применении, а также при создании изделий медицинского назначения, например, устройств, входящих в состав аппаратов для искусственной вентиляции легких, венозных катетеров и раневых покрытий.