ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ АНАЛОГОВ ТИМОГЕНА ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ

Цель – изучить эффекты тимогена и его структурных аналогов на функциональную активность нейтрофилов крови при токсическом поражении печени тетрахлорметаном и солянокислым гидразином. 

Материалы и методы. Тетрахлорметановую гепатопатию, сопровождающуюся увеличением иммунной реактивности, моделировали 5-кратным внутрижелудочным введением четыреххлористого углерода. Поражение печени гидразином, ассоциированное с иммуносупрессией, вызывали однократным внутрибрюшинным введением гепатотропного яда. Крысам внутрибрюшинно на протяжении 5 дней вводили тимоген (1 мкг/кг) и его структурные аналоги (1,2 мкг/кг). При тетрахлорметановой гепатопатии пептиды вводили одновременно с гепатотропным ядом, при гидразиновой – через 24 часа после интоксикации. Оценивали фагоцитарную и кислородзависимую активности нейтрофилов. 

Результаты. Установлено, что при поражении печени тетрахлорметаном тимоген не оказывает корригирующего действия на функциональную активность нейтрофилов. Структурные аналоги снижали активность нейтрофилов в условиях гиперактивации иммунной системы. При гидразиновой гепатопатии все пептиды проявляли иммуностимулирующую активность, при большей ее выраженности у структурных аналогов тимогена. 

Заключение. Модифицированные D-аланином аналоги тимогена оказывают иммуномодулирующее действие при токсических гепатопатиях с разным уровнем иммунной реактивности. 

Ключевые слова: тимоген; D-аланин; токсическая гепатопатия; тетрахлорметан; гидразин; функция нейтрофилов. 

Чуланова Анна Александровна – ст. преподаватель кафедры биологической химии, КГМУ, г. Курск. ORCID iD: 0000-0003-0990-0390. E-mail: chulanofs@mail.ru
Смахтина Ангелина Михайловна – очный аспирант кафедры фармакологии, мл. науч. с. НИИ общей патологии, КГМУ, г. Курск. ORCID iD: 0000-0001-8458-3925. E-mail: smaxtina2012@yandex.ru (автор, ответственный за переписку).
Маль Галина Сергеевна – д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой фармакологии, КГМУ, г. Курск. ORCID iD: 0000-0003-1712-5005. E-mail: mgalina.2013@mail.ru Бобынцев Игорь Иванович – д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой патофизиологии, директор НИИ общей патологии, КГМУ, г. Курск. ORCID iD: 0000-0001-7745-2599. E-mail: bobig@mail.ru
Смахтин Михаил Юрьевич – д-р биол. наук, профессор, профессор кафедры биологической химии, КГМУ, г. Курск. ORCID iD: 0000-0001-7372-1819. E-mail: m.yu.smakhtin@mail.ru
Мишина Екатерина Сергеевна – канд. мед. наук, доцент, доцент кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии, КГМУ, г. Курск. ORCID iD: 0000-0003-3835-0594. E-mail: mishinaes@kursksmu.net
Копейкин Павел Максимович – канд. биол. наук, ген. директор, ООО «АйКьюКемикал», г. Санкт-Петербург. ORCID iD: 0000-0002-6076-8842. E-mail: pmkopeikin@gmail.com
Богомолова Елена Григорьевна – канд. биол. наук, рук. лаборатории, ООО «АйКьюКемикал», г. СанктПетербург. ORCID iD: 0000-0003-4047-4086. E-mail: elenabogomolova000@gmail.com 

Заболевания печени представляют важную медико-социальную проблему [1], поэтому разработка новых гепатопротекторных лекарственных средств остается актуальной. Пептидные лекарственные средства используются в клинической практике, однако их эффекты могут быть снижены ввиду короткого периода полужизни, опосредованного высокой активностью протеолитических ферментов. Интерес к олигопептидам, содержащим D-аминокислоты, в последнее время значительно вырос, так как их введение в структуру молекулы пептида может не только увеличивать его биологическую устойчивость [2-4], но и менять направленность действия [2].

Препарат «Тимоген» (ЗАО МБНПК «Цитомед», Россия) является дипептидом, проявляющим иммуномодулирующие свойства [5]. Ранее нами было установлено, что присоединение аминокислоты D-аланин (D-Ala) к N- или C-концу пептида приводило к увеличению его репаративной и антиоксидантной активности при токсических поражениях печени, вызванных тетрахлорметаном (CCl4) и солянокислым гидразином (N2H4∙2НCl) [6, 7]. Известно, что данные экспериментальные модели поражения печени сопровождаются разным уровнем иммунной реактивности: пятикратное введение тетрахлорметана приводит к увеличению иммунной функции, однократное введение гидразина – к ее снижению [8]. Представляется важным оценить иммунотропное действие аналогов тимогена, модифицированных D-Ala с N- или C-конца пептидной молекулы, при токсических гепатопатиях с разным иммунным статусом.

Целью данной работы являлось изучение эффектов тимогена и его структурных аналогов на функциональную активность нейтрофилов крови при токсическом поражении печени тетрахлорметаном и гидразином.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 80 крысах самцах Вистар массой 180–220 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Выполнены 2 серии экспериментов. Токсическую гепатопатию в 1-й серии моделировали 5-кратным внутрижелудочным введением 50% раствора четыреххлористого углерода, разведенного в растительном масле, в объеме 3 мл/кг. Поражение печени во 2-й серии вызывали однократным внутрибрюшинным введением солянокислого гидразина, растворенного в физиологическом растворе, в дозе 50 мг/кг в объеме 0,1 мл. Данные токсические агенты рекомендованы для использования в эксперименте при исследовании потенциальных гепатопротекторов [9].

Использовали тимоген в форме раствора для парентерального введения и его структурные аналоги: NH2-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH (D-Alaтимоген) и NH2-L-Glu-L-Trp-D-Ala-COOH (тимоген-D-Ala). Модифицированные аналоги были синтезированы в лаборатории синтеза пептидов ООО «АйКьюКемикал» (Санкт-Петербург, Россия). Пептиды использовали в эквимолярных концентрациях: доза тимогена составила 1 мкг/кг массы тела, доза структурных аналогов – 1,2 мкг/кг. Все пептиды разводили до нужной концентрации физиологическим раствором и вводили внутрибрюшинно (0,1 мл) на протяжении 5 дней при двух моделях токсической гепатопатии. При тетрахлорметановой гепатопатии пептиды вводили одновременно с поступлением гепатотропного яда, при поражении печени гидразином – через 24 часа после интоксикации. Животным из интактной и контрольной групп внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в объеме 0,1 мл.

Для выведения животных из эксперимента использовали хлоралгидратный наркоз (300 мг/кг). Забой крыс осуществляли путем обескровливания через 12 часов после последнего введения пептидов. Кровь забирали из правого желудочка. 

Состояние иммунной реактивности оценивали по фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофилов. Для выделения нейтрофилов использовали фиколл-верографиновый градиент. Активность фагоцитоза исследовали после инкубации нейтрофилов с латексом в термостате (37°С). Мазки окрашивали по Романовскому, определяли фагоцитарный индекс (ФИ) на световом микроскопе исследовательского класса Nikon ECLIPSE NI (Япония). В каждом мазке просчитывали 100 нейтрофилов [10].

Активность кислородзависимых механизмов защиты определяли микроскопически на том же микроскопе по спонтанному (НСТ-сп.) и индуцированному зимозаном (НСТ-инд.) тесту восстановления нитросинего тетразолия. Оценивали количество диформазан-положительных фагоцитов (в %) на 100 клеток [11]. Функциональный резерв нейтрофилов (ФРН) рассчитывали как разность между показателями индуцированного и спонтанного НСТ-теста.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения STATISTICA 13.3 (TIBCO Software Inc., США). Данные представлены в виде медианы (Ме) и межквартильного размаха (Q1; Q3). Для сравнения интактной и контрольной групп использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, для сравнения контрольной с опытными группами – критерий КрускалаУоллиса. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что пятикратное введение тетрахлорметана приводило к увеличению фагоцитарной (ФИ) и кислородзависимой (НСТ-сп., НСТ-инд.) активностей нейтрофилов (табл. 1). В условиях гиперактивации иммунной функции введение тимогена не приводило к коррекции изучаемых показателей. При этом использование модифицированных аналогов снижало бактерицидную активность нейтрофилов. Введение D-Ala-тимоген уменьшало НСТ-сп. и НСТ-инд. в 1,5 раза (p<0,05), тимоген-D-Ala – в 1,5 и 1,6 раза соответственно (p<0,05). Достоверных изменений по ФИ и ФРН при использовании тимогена и его структурных аналогов не было установлено.

Отравление солянокислым гидразином вызывало иммуносупрессию, которая проявлялась в достоверном снижении всех изучаемых показателей (табл. 2). Введение пептидов увеличивало функциональную активность нейтрофилов. Структурные аналоги обладали более выраженным по сравнению с тимогеном иммуностимулирующим действием. Эффекты трипептидов были сопоставимы между собой.

Известно, что тимоген обладает широким спектром иммунотропных эффектов. Так, дипептид стимулирует дифференцировку и пролиферацию Т-лимфоцитов, регулирует количество и соотношение Т-хелперов и Т-супрессоров [12, 13] из-за усиления экспрессии рецепторов Thy-1 на лимфоцитах [13]. Также тимоген повышает активность нейтрофилов, моноцитов и NK-клеток, оказывая регулирующее действие на клеточный и гуморальный иммунитет [12]. Кроме того, препарат стимулирует активность цАМФ-зависимых протеинкиназ в лимфоцитах тимуса и селезенки [13], что может модулировать их клеточный метаболизм и выработку цитокинов. В частности, дипептид способен снижать количество провоспалительных цитокинов [15]. Также тимоген активирует группу генов TLR/RLR-сигнальных путей врожденного и адаптивного иммунитета, которые влияют на клеточную дифференцировку [14].

Таблица 1. Иммунотропное действие тимогена и его аналогов при поражении печени тетрахлорметаном

Таблица 2 Table 2 Влияние тимогена и его аналогов на функциональную активность нейтрофилов при поражении печени солянокислым гидразином (Me [1Q; 3Q])

Вид связи (α или γ) в молекуле L-Glu-L-Trp не влияет на выраженность иммуностимулирующей активности. Однако замена одной из аминокислот пептида на ее D-конфигурацию (L-Glu→D-Glu или L-Trp→D-Trp) приводила к значительному снижению иммунной активации при использовании данных аналогов. Энантиомеры тимогена, состоящие только из D-аминокислот, независимо от типа связи проявляли иммуносупрессивные эффекты [13]: изменение конфигурации аминокислот в первоначальной молекуле пептида существенно влияет на выраженность и направленность эффектов молекулы. Предположительно D-пептиды и пептиды, содержащие D-аминокислоты, могут индуцировать уникальный иммунный ответ, механизмы которого полностью не изучены [16]. 

При изучении распределения в организме крысы тимогена было установлено, что наибольшее поглощение имели печень, надпочечники, почки, лимфатические узлы и плазма [17]. Так как в настоящее время печень рассматривается в качестве иммунного органа, регулирующего реакции врожденного и адаптивного иммунитета [18, 19], высокое накопление препарата в печени может объяснять его эффекты. Возможно, отсутствие корригирующего эффекта тимогена в условиях гиперактивации иммунной системы связано с непродолжительным периодом полужизни, в связи с чем его действие на системном уровне нивелируется значительным синтезом печенью белков острой фазы из-за отравления тетрахлорметаном. 

Вероятно, распределение исследованных нами трипептидов в организме аналогично тимогену. Известно, что L-пептиды с концевым введением D-аминокислот длительно сохраняются in vivo [16], с чем может быть связано иммуномодулирующее действие модифицированных аналогов: коррекция иммунных нарушений на органном уровне приводит к снижению продукции белков острой фазы и интерлейкина-6, усиливающих воспалительные реакции на системном уровне [18]. Кроме того, D-Ala может уменьшать воспалительную реакцию за счет снижения уровней провоспалительных цитокинов [20], что может являться дополнительным аспектом снижения иммунного ответа при использовании структурных аналогов в условиях поражения печени тетрахлорметаном. Увеличение фагоцитарной и кислородзависимой активностей нейтрофилов при иммуносупрессии может быть связано с пролонгированием действия молекулы пептида из-за повышения ее устойчивости к протеолизу. 

На основании результатов наших предыдущих исследований [6, 7] можно заключить, что тимоген-D-Ala наиболее перспективен для дальнейших исследований из-за более высокой стабильности антиоксидантных, репаративных и иммунотропных эффектов при токсических гепатопатиях с разным иммунным статусом. 

Таким образом, присоединение D-аланина к молекуле тимогена с N- и C-конца усиливает иммунотропную активность пептидов при поражении печени тетрахлорметаном и солянокислым гидразином. Модифицированные аналоги оказывают иммуномодулирующее действие при токсических гепатопатиях с разным уровнем иммунной реактивности. 

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ 

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи. 

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ 

Исследование проведено в рамках внутривузовского гранта КГМУ (договор возмездного оказания услуг № 37 от 25.01.2024 г.). 

СООТВЕТСТВИЕ ПРИЦИПАМ ЭТИКИ 

Эксперимент одобрен Этическим комитетом Курского государственного медицинского университета (Протокол № 6 от 6 ноября 2018 г.) и проведен в соответствии с принципами ARRIVE и Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета ЕС по охране животных, используемых в научных целях. 

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРОВ 

Чуланова А.А. – участие в разработке концепции и дизайна исследования, проведение экспериментов, статистическая обработка, анализ и интерпретация результатов, написание рукописи; Смахтина А.М. – участие в разработке концепции и дизайна исследования, проведение экспериментов, статистическая обработка, анализ и интерпретация результатов, написание рукописи; Маль Г.С. – участие в разработке концепции и дизайна исследования, анализ и интерпретация результатов, проверка критически важного интеллектуального содержания; Бобынцев И.И. – участие в разработке концепции и дизайна исследования, анализ и интерпретация результатов, написание рукописи; Смахтин М.Ю. – участие в разработке концепции и дизайна исследования, анализ и интерпретация результатов, проверка критически важного интеллектуального содержания, окончательное утверждение рукописи для публикации; Мишина Е.С. – анализ и интерпретация результатов, проверка критически важного интеллектуального содержания; Копейкин П.М. – синтез структурных аналогов тимогена, написание рукописи; Богомолова Е.Г. – синтез структурных аналогов тимогена, написание рукописи.