МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДА ВРОЖДЁННОГО ИММУНИТЕТА ПРОТЕГРИНА 1 НА МЕМБРАНЫ БАКТЕРИИ E.COLI E.COLI ML35P

МЕМБРАНОСЕЛЕКТИВНЫЕ СТРУКТУРНЫЕ ВАРИАНТЫ ПРОТЕГРИНА-1*

Антибиотические пептиды — молекулярная основа системы врожденного иммунитета человека и животных. Их изучение ведет не только к пониманию фундаментальных закономерностей иммунитета, но и открывает перспективы практического использования полученных результатов [1, 2]. Рост резистентности патогенных микроорганизмов к современным антибиотикам важнейшая проблема медицины [9]. Одним из ее решений может быть создание на основе природных антимикробных пептидов антибиотиков нового поколения. Главной трудностью в данной области является преодоление токсичности пептидов — способности разрушать не только микробные, но и животные клетки, прежде всего, эритроциты человека [12,3]. Токсичность природного антимикробного пептида протегрина-1 (PG-1), выделенного из лейкоцитов свиньи, является основным препятствием при разработке антибиотического препарата на его основе. Структурно-функциональный анализ синтетических структурных модификаций природного протегрина может привести к выявлению пептидов, имеющих высокую антимикробную активность и сниженную токсичность в отношении нормальных клеток человека. 

Нами был синтезирован ряд модификаций PG-1 и проведено изучение их свойств с целью обнаружения молекул, обладающих сниженной гемолитической активностью, а также выбора направления модификации структуры протегриноподобных пептидов. В состав молекул всех изучаемых структурных модификаций PG-1 входил участок CRRRFC, который, как было показано ранее [8], является необходимым для проявления антимикробной активности протегрина. Одной из важных характерных особенностей структуры PG-1 является наличие двух дисульфидных связей, обусловливающих его конформацию бета-шпильки. Были изучены аналоги PG-1, отличающиеся от нативного пептида как заменами отдельных аминокислотных остатков, так и расположением S-S мостиков, при котором менялась конформация молекулы. В настоящей работе представлены данные о биологической активности четырех химически синтезированных аналогов протегрина: P-45: RRLCYCRRRFCICV (S-S-связи: C4-C11, С6-С13), P-85: RRFCNPCRRRFCK (S-S-связи: С3-С8), P-88: LGGCRRRFCNPSCK (S-S-связи: C4-C9), P-90: LYCADPRCRPCRRRFCNPCADPRCKH (S-S-связи: C3-C8, C11-C16, C19-C25). С-конец молекул всех синтетических пептидов, как и PG-1, амидирован. Была изучена антибиотическая активность синтетических пептидов в отношении ряда микроорганизмов E. coli, Listeria monocytogenes, Candida albicans и гемолитическая активность в отношении эритроцитов человека. Проведено сравнение со свойствами природного протегрина: PG-1: RGGRLCYCRRRFCVCVGR (S-S-связи: С6-С15, C8-C13). 

Материалы и методы исследования. 

Реактивы. В работе использовались триптический гидролизат сои и среда Сабуро фирмы HighMedia (Индия), нитроцефин фирмы Calbiochem (США), агароза, о-нитрофенил-β-D-галактопиранозид (ONPG), а также и другие вещества, полученные от фирмы Sigma (США). 

Синтез пептидов. Твердофазный синтез структурных модификаций протегрина-1 осуществляли на автоматическом пептидном синтезаторе Inavis AG (Германия) с помощью Fmoc технологии [6] и методических подходов, описанных ранее [7]. Очистку пептидов проводили с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонках Vydac C18хроматографа Gilson (Франция). Чистоту полученных пептидов подтверждали с помощью аналитической ВЭЖХ на колонках Vydac C18, а также масс-спектрометрического анализа (MALDI TOF MS). Локализацию дисульфидных связей подтверждали масс-спектрометрическими методами [7] на установке FINIGAN MAT95 («TermoQuest», Германия). 

Оценка антимикробной активности пептидов методом радиальной диффузии в агарозных гелях. Антибиотическое действие пептидов определяли по методу, предложенному Лерером и соавторами [5]. В работе использовали культуры следующих микроорганизмов: Esherichia coli, штамм ML-35р (грамотрицательная бактерия); Listeria monocytogenes, штамм EGD (грамположительная бактерия); Candida albicans 820 (низший гриб). Микроорганизмы культивировали в течение 16–18 ч в среде, содержащей 3 %-ный раствор триптического гидролизата сои (ТГС) при 37 °С. Из полученной культуры отбирали 100 мкл суспензии для E. coli или 700 мкл для Listeria monocytogenes и переносили в 50 мл свежеприготовленного триптического гидролизата сои, после чего инкубировали при 37 °С в течение 2,5 ч для получения микроорганизмов, находящихся в логарифмической фазе роста. В случае с Candida albicans использовали ночную культуру. Суспензии микроорганизмов далее центрифугировали при 2000 об./мин в течение 10 мин, осадок дважды промывали 10 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7,4) и ресуспендировали в 3 мл того же буфера. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизмов оценивали, измеряя оптическую плотность суспензий на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 620 нм (величина оптической плотности 0,2 соответствует 5×107КОЕ в мл [5]). В случае C. albicans количество клеток подсчитывали под микроскопом в камере Горяева. Для приготовления агарозных гелей, содержащих микроорганизмы, рассчитывали объем суспензии, в котором содержится 4×106 КОЕ, добавляли этот объем к 10 мл стерильного 1%-ного раствора агарозы в 10мМ натрий-фосфатном буфере [рН 7,4] при температуре 43 °С. Полученную смесь выливали в стерильную пластиковую чашку Петри диаметром 90 мм, где смесь застывала с образованием агарозного геля. Приготавливали серийные (двукратные) разведения исследуемых пептидов в 0,01 %-ном водном растворе уксусной кислоты (УК). В агарозных гелях, содержащих микроорганизмы, делали отверстия диаметром 2 мм. В лунки вносили анализируемые образцы, содержащие пептид, и инкубировали в течение 3 ч при 37 °С. За время инкубации пептиды диффундировали из лунок в агарозные гели. По окончании инкубации на поверхность агарозного геля наносили 1%-ный раствор агарозы, содержащий 6 %-ный триптический гидролизат сои. Затем чашки инкубировали еще в течение 20 ч при 37 °С. 

Для количественной оценки антибиотического действия пептидов измеряли диаметр зоны ингибирования роста микрорганизмов вокруг лунок, принимая за 1 единицу 0,1 мм и вычитая из измеренного значения 20 единиц, соответствующих диаметру лунки. Для каждого пептида определяли минимальную ингибирующую рост микорбов концентрацию (МИК). Для этого строили графики зависимости антимикробной активности пептидов от их концентрации. За МИК принимали значение, полученное для точки пересечения графика линейной регрессии с осью абсцисс для каждого пептида (концентрация пептидов в мкМ). 

Оценка способности пептидов влиять на проницаемость наружной и цитоплазматической мембран E. coli ML35p [11]. Принцип метода: оценивается увеличение проницаемости мембран бактерии E. coli ML35p для хромогенных маркеров — о-нитрофенил-β-D-галактопиранозида (ONPG) и нитроцефина, являющихся субстратами для ферментов β-галактозидазы и β-лактамазы соответствено; а также для продуктов этих ферментативных реакций. Используемый в данном методе штамм E. coli ML35p характеризуется тем, что у этой бактерии отсутствует пермеаза лактозы (фермент, осуществляющий транспорт лактозы в клетку), а синтез фермента β-галактозидазы в цитоплазме не индуцибельный, как у большинства бактерий, а конститутивный. Кроме того, в периплазматическом пространстве E. coli ML35p находится фермент β-лактамаза [4]. При наличии в среде, окружающей бактерию, субстратов для β-галактозидазы или β-лактамазы ферментативные реакции с участием данных субстратов могут происходить только в том случае, если эти субстраты способны проникать через мембраны бактерии. 

Так как в результате ферментативных реакций с используемыми нами субстратами образуются окрашенные продукты, то о ходе ферментативной реакции можно судить по изменению оптической плотности растворов на определенных длинах волн. Однако пока целостность мембран бактерии не нарушена, данные ферментативные реакции с используемыми субстратами не идут. Если же под действием какого-либо повреждающего агента, например антимикробного пептида, наружная мембрана E. coli ML35p становиться проницаемой для нитроцефина (а также для продукта ферментативной реакции), то нитроцефин может проникнуть в периплазматическое пространство и подвергнуться гидролизу в результате ферментативной реакции, катализируемой β-лактамазой, которая расщепляет β-лактамное кольцо, входящее в состав нитроцефина. Образующийся в результате реакции продукт гидролиза нитроцефина выходит в среду, и поглощение света раствором при длине волны 490 нм увеличивается, причем, наблюдая кинетику ферментативной реакции, можно судить и о динамике процесса действия антимикробного пептида на внешнюю мембрану бактерии. 

Аналогично, когда в результате действия антимикробного пептида цитоплазматическая (и также наружная) мембрана бактерии становится проницаемой для ONPG, а также продукта ферментативной реакции, катализируемой β-галактозидазой (о-нитрофенола), о-нитрофенол выходит из бактериальных клеток в среду, что можно детектировать, измеряя поглощение света раствором при длине волны 420 нм, и, таким образом, наблюдать за процессом повреждения внутренней мембраны бактерии под действием антимикробного пептида. Хотя данный метод не позволяет нам сделать прямые выводы о механизме антимикробного действия исследуемого пептида, он позволяет выявить пептиды с выраженным мембранолитическим действием, а также сравнить характер действия на мембраны различных пептидов.

В эксперименте использовали ночную культуру E. coli ML35p. Суспензию бактерий центрифугировали при 2000 об./мин в течение 10 мин, осадок дважды промывали в 10 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7,4) и ресуспендировали в 3 мл того же буфера. Количество КОЕ в 1 мл раствора определяли, измеряя оптическую плотность суспензии при длине волны 620 нм, как описано выше. Нитроцефин и ONPG растворяли в том же буфере. Препараты пептидов растворяли в 0,01%-ной УК. Конечная концентрация составляющих лунок планшета: 20 мкМ нитроцефина, либо 2,5 мМ ONPG, 2,5 × 107 КОЕ E. coli/мл, 10 мкМ пептидов, 10 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,4. Контрольные пробы содержали вместо пептидов 10 мкл 0,01 %-ного раствора УК. Суспензию бактерий приготавливали непосредственно перед экспериментом и добавляли в лунки 96-луночных планшетов, куда уже были добавлены пептиды и нитроцефин либо пептиды и ONPG. После этого немедленно ставили планшеты для измерения оптической плотности растворов с помощью спектрофотометра SpectraMax 250 фирмы Molecular Devices. Эксперимент проводили при температуре 37 оС и периодическом встряхивании планшетов. О способности пептидов вызывать увеличение проницаемости наружной мембраны E. coli ML35p судили по увеличению оптической плотности раствора при длине волны 490 нм, а цитоплазматической мембраны — при длине волны 420 нм. 

Анализ гемолитической активности пептидов в отношении эритроцитов человека. Кровь собирали в пластиковые пробирки, в которые предварительно добавляли гепарин из расчета 10 мкл гепарина на 1 мл крови. Затем кровь центрифугировали в течение 10 мин (1000 об./мин, 4 °С). Супернатант удаляли. К осадку добавляли 10 мл охлажденного забуференного (ЗФР) физиологического раствора, рН 7,4 и 4 мМ ЭДТА, затем центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об./мин с охлаждением 4 оС. Надосадочную жидкость удаляли и доводили оставшийся объем до 10 мл добавлением ЗФР, перемешивали, центрифугировали при тех же условиях. Процедуру отмывания эритроцитов повторяли три раза. Из полученного осадка эритроцитов (принималось, что в осадке содержание эритроцитов 100 %) отбирали 280 мкл, доводили объем суспензии до 10 мл охлажденным ЗФР. Таким образом, конечное содержание эритроцитов в растворе составляло 2,8 %. 

Анализ гемолитической активности пептидов проводили в пробах следующего состава: из 90 мкл 2,8%-ной суспензии эритроцитов и 10 мкл анализируемого пептида. После добавления пептидов получали 2,5%-ные суспензии эритроцитов. Серийные разведения анализируемых пептидов делали в 0,01%-ной УК. Для получения положительного контроля (100 %-ный лизис эритроцитов) к 90 мкл раствора эритроцитов добавляли 10 мкл детергента (10 %-ный Triton X-100 в водном растворе, содержащем 0,01%-ную УК). Для получения негативного контроля (0%-ный лизис эритроцитов) к 90 мкл раствора эритроцитов добавляли 10 мкл 0,01 %-ной УК. Анализируемые растворы инкубировали при 37 °С в течение 30 мин. После  инкубации реакцию останавливали добавлением 150 мкл охлажденного ЗФБ, пробы центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 4 мин. Супернатант отбирали и вносили в ячейки 96-луночного планшета (Costar, Corning Inc.). Измерение оптической плотности проб при длине волны 540 нм производили на фотометре SpectraMax 250 фирмы Molecular Devices (США). Процент гемолиза рассчитывали по формуле:

Результаты исследования. 

Таблица 1. Минимальная ингибирующая концентрация (мкМ) протегрина — 1 и его структурных аналогов P-45, P-85, P-88, P-90

Изучение антимикробной активности пептидов. Антимикробную активность протегрина-1 и его структурных модификаций оценивали с помощью метода радиальной диффузии в агарозных гелях. На рис. 1 представлены графики зависимости антимикробной активности пептидов от их концентрации. Из приведенных графиков определяли минимальные концентрации пептидов, ингибирующие рост микроорганизмов (МИК). За МИК принимали точку пересечения представленных на графиках прямых линейных регрессий с осью абсцисс. Полученные значения МИК представлены в таблице. Из таблицы видно, что нативный PG-1 обладал высокой антимикробной активностью в отношении всех трех исследуемых микроорганизмов, причем его антимикробное действие проявлялось в концентрациях около 1 мкМ. Химически синтезированные модификации PG-1 в целом оказались менее активными. Пептид Р-45, наиболее близкий по первичной структуре к PG-1, проявил наибольшую антимикробную активность в отношении всех трех микробов, в то время как пептиды Р-88 и Р-85 были значительно менее эффективны в отношении грамотрицательной бактерии и грибка. Пептид Р-90 имел сравнимую с Р-45 активность против бактерий, но сниженную в отношении Candida albicans.

Рис. 1. Зависимость антимикробной активности против Esherichia coli ML35p от концентрации пептидов, выраженной в условных единицах

Изучение действия пептидов на наружную и внутреннюю мембраны E. coli ML 35p. Для выявления повышения проницаемости бактериальных мембран, основного механизма действия большинства антимикробных пептидов, были проведены эксперименты с использованием хромогенных маркеров проницаемости наружной и внутренней мембраны E. coli ML35p. О повреждающем действии пептидов на мембраны бактерии судили по увеличению проницаемости мембран для хромогенных маркеров — продуктов ферментативных реакций, субстраты к которым (нитроцефин и ортонитрофенилгалактопиранозид (ONPG) присутствовали в инкубационной среде, а ферменты, катализирующие реакции находились в периплазматическом пространстве (β-лактамаза) и в цитоплазме (β-галактозидаза); причем ферментативные реакции шли, а продукты реакций поступали в среду только при условии повреждений в мембранах. За процессом увеличения концентрации продуктов в среде следили с помощью спектрофотометра,измеряя поглощение света раствором придлине волн,накоторых маркеры проницаемости (продукты реакции) имеют максимум поглощения. На рис. 2 представлены графики, демонстрирующие процесс увеличения проницаемости для продуктов гидролиза нитроцефина иONPGприинкубации бактерии спептидами,взятыми вконцентрации 10мкМ и, таким образом, свидетельствующие о повреждающем действии пептидов на мембраны.

Рис. 2. Кинетика изменения проницаемости мембран E.coli ML35p для хромогенных маркеров при действии различных антимикробных пептидов (концентрация 10 мкМ)
По оси абсцисс — оптическая плотность раствора, содержащего хромогенные маркеры (продукт гидролиза нитроцефина в случае наружной мембраны и продукт гидролиза ONPG (о-нитрофенол) в случае внутренней мембраны); по оси ординат — время инкубации пептидов с бактерией (мин). Контролем служили пробы, в которые вместо пептидов добавляли равные объемы буфера.

PG-1 вызывал быстрый и выраженный рост проницаемости внешней и внутренней мембран уже через 2–3 мин после начала эксперимента. Эффекты синтетических пептидов отличались от характерных для природного PG-1. Наиболее выраженное действие на наружную мембрану бактерии оказывал пептид Р-45, а остальные пептиды, влияли на проницаемость наружной мембраны E. coli, но в меньшей степени. Эффект исследуемых пептидов на внутреннюю мембрану бактерии еще более заметно отличался от действия PG-1: Р-45 вызывал некоторое увеличение проницаемости, но только через 60 мин после начала эксперимента, остальные пептиды не влияли на проницаемость цитоплазматической мембраны бактерии. 

Оценка гемолитической активности пептидов в отношении эритроцитов человека. Анализ гемолитической активности пептидов в отношении эритроцитов человека показал, что исследуемые пептиды обладают сниженной гемолитической активностью, по сравнению с природным протегрином-1 (рис. 3). Так PG-1 в концентрации 20 мкМ вызывал лизис около 60 % эритроцитов, P-45 — 25 %, P-85 — 5 %, а P-90 и P-88 практически не обладали гемолитической активностью в исследуемом диапазоне концентраций от 2 до 80 мкМ.

Рис. 3. Зависимость гемолиза эритроцитов от концентрации пептидов
По оси ординат — гемолиз эритроцитов в процентах (за100 % принимали величину, полученную при действии на эритроциты 10 %-ного раствора Тритона Х-100).

Обсуждение результатов исследования. Антимикробный пептид из лейкоцитов свиньи протегрин-1 (PG-1) был открыт 15 лет назад и благодаря своей антибиотической активности широкого спектра действия стал объектом многих исследований. PG-1 представляет собой катионный пептид с молекулярной массой 2155 Да, обладающий конформацией бета-шпильки [3]. Молекула PG-1 амфипатична и, благодаря наличию положительно заряженных аминокислотных остатков, связывается с отрицательно заряженными компонентами на поверхности микробных клеток, присутствие же гидрофобных аминокислотных остатков позволяет встраиваться в липидные мембраны и образовывать поры. Порообразование приводит к утечке ионов и осмотическому разрушению микроорганизмов. Бактерицидное действие развивается быстро,не позволяя микроорганизмам сформировать защитныемеханизмы,обусловливающиерезистентность.Токсичностьпротегринавотношении  эритроцитов человека не позволила разработать лекарственный препарат на основе структуры PG-1донастоящего времени. Нами разработан иисследован ряд синтетических модификаций PG-1, имеющих различное количество и местоположение дисульфидных связей. 

Антимикробная активность синтезированных пептидов (Р-90, Р-88, Р-45) ниже, чем у природного PG-1, однако сравнима с активностью изученных природных антимикробных веществ [1]. Эффекты действия исследованных нами пептидов на мембраны бактерий отличались от свойственных PG-1, поэтому можно предположить, что они имеют иной основной механизм антимикробного действия. Наиболее интересным свойством полученных пептидов является их низкая гемолитическая активность (Р-90 и Р-88).

Полученные нами данные позволяют сделать вывод, что расположение дисульфидных связей в протегриноподобных пептидах может влиять на степень гемолитической активности в отношении эритроцитов человека. Ранее сходные данные были получены другими исследователями в ходе анализа свойств циклических протегриноподобных пептидов [10] и при изучении модификаций протегрина-1 с заменой отдельных аминокислот, не приводящих к утрате структуры ß-шпильки [8]. Структуры синтетических пептидов с низкой гемолитической активностью, использованных в нашей работе, содержат характерный для PG-1 фрагмент CRRRFC, но имеют отличное расположение S-S-связей, при котором конформация ß-шпильки нарушается. Полученные данные могут свидетельствовать в пользу предположения о важности особенности структуры PG-1 для проявления им гемолитической активности. Поскольку высокая гемолитическая активность в отношении эритроцитов человека является важнейшим свойством, ограничивающим возможное клиническое применение высокоактивного антимикробного пептида протегрина-1, полученные экспериментальные данные указывают на перспективность структурно-функционального анализа подобных синтетических модификаций.